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背景：

RANKL是肿瘤坏死因子配体超家族成员11，也称为核因子kappa-B受体激活因子的配体，骨保护素配体，TNFSF11，RANKL，TRANCE，OPGL和CD254, 在多种细胞中表达，如成骨细胞，成纤维细胞，活化的T淋巴细胞，以及骨髓间质细胞。RANKL可以与诱骗受体OPG反应，并参与许多基础生物学过程，例如充当T细胞与树突状细胞之间相互作用的调节因子，调节T- 细胞依赖的免疫效应，并可以增强高钙血症的骨吸收。重要的是，RANKL可以增强树突状细胞刺激初始T细胞的增殖能力。

标记：

1.将细胞培养基与EdU溶液按照500：1的比例混合，制成2×EdU标记培养基。

2.提前将2×EdU标记培养基预热，然后将150微升2×EdU标记培养基与等体积细胞培养基混合，获得1×EdU溶液。

【注】：①不建议替换全部培养基，这样可能会影响细胞增殖的速度。②配置好的培养基建议现用现配，用量以没过细胞为宜。

3.孵育细胞2 h，弃培养基。

【注】：①培养时间取决于细胞的增殖速度和生长状态。②大多数肿瘤细胞以及粘附细胞系均可采用2 h的孵育时间。

4.以1xPBS清洗细胞两次，每次5 min, 以除去未掺入DNA的EdU残留。

【注】：对于贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。

实验步骤：

1. 将细胞以 104-105 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板 中，加入 100μL 培养基，含或不含待测化合物。在 CO2 培养箱中在 37℃ 下培养细胞 24 小时。

2. 向板中加入 10μL 不同浓度的待测物质。

3. 在培养箱中将培养板培养适当时间（如 6、12、24 或 48 小时）。

4. 向板的每个孔中加入 10μL CCK-8 溶液。小心不要将气泡引入孔中。

5. 将平板在培养箱中孵育 1-4 小时。

6. 在读板之前，在定轨振荡器上轻轻混匀。

7. 使用酶标仪测量 450nm 处的吸光度。

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