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背景：

骨形态发生蛋白-4（BMP-4）是九种结构相关的骨形态发生蛋白之一，属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族的分泌蛋白。成熟的 BMP-4 是一种二聚体，能与具有丝/苏激酶活性:的多聚跨膜受体结合。BMP-4 可促进 HCC 细胞增殖并诱导自噬。机制研究表明，BMP-4诱导的自噬是通过激活JNK1/Bcl2通路介导的。JNK1抑制剂和JNK1基因敲除可削弱BMP-4诱导的自噬，消除BMP-4促进的HCC细胞生长。BMP-4通过自噬激活JNK1/Bcl-2信号传导促进HCC增殖。

标记：

1.将细胞培养基与EdU溶液按照500：1的比例混合，制成2×EdU标记培养基。

2.提前将2×EdU标记培养基预热，然后将150微升2×EdU标记培养基与等体积细胞培养基混合，获得1×EdU溶液。

【注】：①不建议替换全部培养基，这样可能会影响细胞增殖的速度。②配置好的培养基建议现用现配，用量以没过细胞为宜。

3.孵育细胞2 h，弃培养基。

【注】：①培养时间取决于细胞的增殖速度和生长状态。②大多数肿瘤细胞以及粘附细胞系均可采用2 h的孵育时间。

4.以1xPBS清洗细胞两次，每次5 min, 以除去未掺入DNA的EdU残留。

【注】：对于贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。

实验步骤：

1. 将细胞以 104-105 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板 中，加入 100μL 培养基，含或不含待测化合物。在 CO2 培养箱中在 37℃ 下培养细胞 24 小时。

2. 向板中加入 10μL 不同浓度的待测物质。

3. 在培养箱中将培养板培养适当时间（如 6、12、24 或 48 小时）。

4. 向板的每个孔中加入 10μL CCK-8 溶液。小心不要将气泡引入孔中。

5. 将平板在培养箱中孵育 1-4 小时。

6. 在读板之前，在定轨振荡器上轻轻混匀。

7. 使用酶标仪测量 450nm 处的吸光度。

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